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    從培養(yǎng)的細(xì)胞中純化總RNA的方法

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-24　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1049次

    材料與儀器

    細(xì)胞
    RNA 提取緩沖液 變性液 水飽和酚
    培養(yǎng)皿 Falcon 2063 管

    步驟

    1. 取 1 個(gè)細(xì)胞已長(zhǎng)滿的 100 ml 培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)液，加 2 ml RNA 提取緩沖液，用橡膠刮棒刮下細(xì)胞。

    RNA 提取緩沖液：

    變性液，20 ml

    β-巰基乙醇，0.144 ml

    2 mol/L 乙酸鈉，pH 4，2 ml

    水飽和酚，22 ml    

    可避光保存在 4℃ 2~3 個(gè)月。

    變性液：

    4 mol/L 硫氰酸胍：250 g 硫氰酸胍

    25 mmol/L 檸檬酸鈉：17.6 ml 0.75 mol/L 檸檬酸鈉，pH 7

    0.5% 十二烷基肌氨酸鈉（Sarkoayl）：26.4 ml 10% 十二烷基肌氨酸鈉，293 ml H2O

    混合各組分，在 65℃ 攪拌溶解?？梢栽谑覝乇４?3 個(gè)月。

    水飽和酚：

    用在水浴中加熱到 65℃ 的滅菌水來(lái)溶解酚。從水浴取出后使冷卻到 4℃。加足量水以維持水相（上相）?？稍?4℃ 避光保存 2~3 個(gè)月。

    2. 細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到一個(gè) Falcon 2063 管中，加 200 μl 氯仿，混合均勻。

    3. 細(xì)胞冰浴 15 分鐘。

    4. 細(xì)胞裂解物在 4℃ 以 5000 g 離心 30 分鐘。

    5. 轉(zhuǎn)移水（上）相，注意不要攪動(dòng)交界面，水相放到一個(gè)干凈的 Falcon 2063 管中并加入 1 ml 異丙醇（僅用于 RNA 工作的溶液）。

    6. 管子在  -20℃ 放至少 1 小時(shí)或過(guò)夜。

    7. 用固定角度的轉(zhuǎn)頭在 4℃ 以 8000 g 離心 30 分鐘沉淀 RNA，小心去掉上清。

    8. 加 1 ml 70% 乙醇洗白色沉淀物并在以 8000 g 離心 15 分鐘。洗 3 次，不要振搖。

    9. 最后一次 70% 乙醇洗滌后，去掉乙醇并稍稍離心管子收集殘液。吸掉剩下的乙醇。

    10. 短時(shí)間干燥沉淀。空氣干燥約 30 分鐘或在真空干燥器中 2~3 分鐘。

    11. 用 50~100 μl DEPC 處理過(guò)的水重懸 RNA，測(cè)量 1:100 稀釋的樣品的光密度（OD260）來(lái)計(jì)算濃度。

    濃度（μg/ml）=（稀釋度）[（40 μg/ml·OD260）]（樣品的 OD260）

    12. 重懸的 RNA 貯存在 -70℃。


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