老話說的好，萬事開頭難。而這話在 RT-PCR 中則較為體現(xiàn)出來，其開頭的第一步——將 RNA 反轉(zhuǎn)為 cDNA，表面上看似簡單，實(shí)際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個坑，就會讓斗志高昂的實(shí)驗(yàn)汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。 

顯然，RNA 的反轉(zhuǎn)錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰(zhàn)、屢戰(zhàn)屢敗，就是因?yàn)楹雎粤艘韵逻@ 6 個要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里看著悲催的實(shí)驗(yàn)結(jié)果唉聲嘆氣呢？

1.RT Primer 的* 

通常 RT primer 可分為三類：oligo dT，隨機(jī)引物以及基因特異性引物。Oligo dT 引物之所以應(yīng)用范圍更加廣泛，是因?yàn)榭捎纱双@得 mRNA 的全長拷貝。 

然而如果 mRNA 長度過長>4kb，或者沒有 polyA 尾（原核 mRNA 或 rRNA），就需要考慮使用隨機(jī)引物進(jìn)行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)引物雖能確保長基因的 5’末端的轉(zhuǎn)錄，但并不能獲得整個基因全長的 cDNAs，且對 RNA 樣品質(zhì)量要求比較高，此時可用 6-8 個核酸聚合體來提高 cDNAs 的合成量。 

而對于真核生物的 qPCR，長隨機(jī)引物和 Oligo-dT 引物的混合物似乎能給出一個漂亮的結(jié)果。針對此類優(yōu)化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev.  Transcription Kit 和 BioRad iScript Kit。 

第三個選擇就是基因特異性引物，僅擴(kuò)增需要的 cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步 RT-PCR 法中可使用此類引物，因?yàn)樵撘镆部捎米鳛?PCR 中的反向引物。

2.RNA 的二級結(jié)構(gòu) 

若要獲取全長 RNA 的反轉(zhuǎn)錄，那么 RNA 二級結(jié)構(gòu)的問題就不可忽略，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶在遇到此類結(jié)構(gòu)后會終止反應(yīng)或從模板上脫落下來。 

也許你很難判斷 RNA 是否具有二級結(jié)構(gòu)，但如果基因中 GC 含量較高，通常意味著 RNA 很難被變性且不可能是單鏈，此時就需要在 65℃ 5min 對其進(jìn)行充分變性，以避免其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 

另外，還有一種方法可解決此問題，即使用一種最適溫度高于正常標(biāo)準(zhǔn)（37℃-42℃）的逆轉(zhuǎn)錄酶。比如來自 Life Technologies 的 Themoscript 酶就常用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu) RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)然也存在一些即使在常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過 RNA 二級結(jié)構(gòu)的高效率逆轉(zhuǎn)錄酶，即使是針對富集 GC 序列的 RNA 也能得到很好的結(jié)果，如 Qiagen 公司的逆轉(zhuǎn)錄酶 Omniscript 和 Sensiscript，以及 Takara Bio 公司的 PrimeScirpt RT enzyme。

3.去除 gDNA 

RNA 中存在的基因組 DNA（gDNA）污染可能是最終 PCR 反應(yīng)中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的原因，目前已存在很多方法去除 gDNA，比如通過 DNAase 對提取的 RNA 進(jìn)行預(yù)處理。 

以上方法無可避免會造成 RNA 的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開酶處理的方法，即針對 RNA 設(shè)計一種包含內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物，如此 DNA 就不會產(chǎn)生擴(kuò)增抑或即便擴(kuò)增了其條帶大小也與 cDNA 不同。 

但值得注意的是，使用該方法時基因中要沒有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因組中剪切 mRNA 的 DNA 拷貝，否則也會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。 

而對于沒有內(nèi)含子的原核 RNA，gDNA 的去除則更是基因表達(dá)準(zhǔn)確測量的一個至關(guān)重要的因素。使用 DNAase 處理 RNA 是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit 中所包含的 gDNA 清除緩沖液就可在無需加熱或 EDTA 失活的條件下降解 DNA。此外，具有 gDNA Eraser（Takara  Bio）的 PrimeScript RT 試劑盒也可去除 gDNA，且能在不到 20 分鐘之內(nèi)快速完成 RNA 的 cDNA 合成。

4.檢測 RNA 分子的完整性 

毫無疑問，RNA 質(zhì)量對 cDNA 合成結(jié)果會產(chǎn)生重要的影響，而不同批次間 RNA 質(zhì)量差異也導(dǎo)致 RT-PCR 產(chǎn)生不同的結(jié)果。所以在進(jìn)行 RT-PCR 前，應(yīng)該檢查 RNA 條帶的質(zhì)量，可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。通常完整的真核 RNA 應(yīng)包括 28S 和 18S RNA 條帶，且較大的條帶的強(qiáng)度應(yīng)是較小條帶的兩倍左右，另外兩個條帶強(qiáng)度大致相同也是可以的。 

而另一種準(zhǔn)確測量 RNA 質(zhì)量的方法是使用 Agilent BioAnalzyer 儀器，它可將 RNA 分子可視化并能在分析 RNA 完整數(shù)值（RNA Integrity Number，RIN）后給出一個質(zhì)量的量化標(biāo)準(zhǔn)。RIN 為 8-10，則表示 RNA 質(zhì)量非常好；當(dāng) RIN 值低于 7，則說明 RNA 可能有降解，可能會導(dǎo)致一些罕見信息的丟失等問題。

5.RNA 定量 

除了掌握 RNA 的完整性之外，準(zhǔn)確評估產(chǎn)量也很重要。產(chǎn)量的準(zhǔn)確性會受到以下因素的影響：測量儀器的準(zhǔn)確性、DNA 的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準(zhǔn)確測量產(chǎn)量，小編我更喜歡使用 Nanodrop 進(jìn)行 UV 定量。 

該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測量 RNA 的范圍。以小編的經(jīng)驗(yàn)，它可以準(zhǔn)確讀取到 10ng / ul。而傳統(tǒng)的紫外分光光度法應(yīng)避免使用大容量的比色皿，因?yàn)檫@需要耗費(fèi)大量的樣品。此法的缺點(diǎn)是也可在樣品中測量基因組 DNA，如果從 RNA 提取過程殘留鹽或酚，則會增加吸光度，使得 RNA 的 OD 值變得更高。 

而解決此問題一個方法是使用熒光染料，Ribogreen 是一種 RNA 特異性染料，可通過熒光來測量 RNA 產(chǎn)量?，F(xiàn)在，Nanodrop 已經(jīng)具備檢測 Ribogreen 所發(fā)出熒光的功能。

6.兩步法或一步法 RT-PCR 

RT-PCR 也分兩種類型：一步法（One-step PCR）和兩步法（Two-steps PCR），具體操作見下圖。前者，RT 反應(yīng)和 PCR 擴(kuò)增是在同一個反應(yīng)管中進(jìn)行的；而后者，RT 反應(yīng)與 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行。

盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。 

一步 RT-PCR 消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來源，而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時間。又因一步 RT-PCR 中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達(dá)水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的基因被擴(kuò)增，且需要在轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增間尋找一個平衡。 

所以當(dāng)時間對實(shí)驗(yàn)很重要時，一般采用一步法，如檢測 RNA 病毒，也適用于高通量分析。由于該法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高，因而在需要測量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時，也可采用此方法。 

而兩步 RT-PCR 可將大批量的 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA，然后儲存 cDNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可檢測大量基因；在分別優(yōu)化 RT 和 PCR 步驟后，可更好地控制實(shí)驗(yàn)過程；又因只有少量的轉(zhuǎn)錄本被用 于 PCR，則任何可能從 RNA 分離到 RT 反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。 

但是兩步 RT-PCR 更耗費(fèi)時間，且?guī)砦廴镜目赡苄愿?；RT 過程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄 RNA， 否則會影響 qPCR 的啟動效率，進(jìn)而帶來不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對于每個 RT 反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件。 

如果你需要對同一樣本的多個目標(biāo)進(jìn)行分析時，可選擇兩步 RT-PCR。另外，當(dāng) RNA 的存儲是個問題時，最好是進(jìn)行兩步 RT-PCR，因?yàn)?cDNA 在-20℃是穩(wěn)定的。

參考文獻(xiàn)：

1、Six Important Factors for Successful Reverse Transcription 

2、How to Choose the Correct Reverse Transcription Method